組織(zhi)細(xi)胞內抗(kang)(kang)(kang)原的(de)(de)(de)(de)固(gu)定(ding)是免(mian)(mian)疫(yi)酶標(biao)和(he)非(fei)標(biao)記免(mian)(mian)疫(yi)酶組織(zhi)化(hua)學方(fang)法(fa)中的(de)(de)(de)(de)重要環節。經過(guo)固(gu)定(ding)，可(ke)以(yi)(yi)達到如下目的(de)(de)(de)(de)：1.標(biao)本(ben)在(zai)玻片上的(de)(de)(de)(de)吸著(zhu)力(li)增加；2.標(biao)本(ben)所含的(de)(de)(de)(de)類脂和(he)蠟質等成(cheng)分可(ke)以(yi)(yi)除去，從而有利(li)于抗(kang)(kang)(kang)原與(yu)酶標(biao)記抗(kang)(kang)(kang)體的(de)(de)(de)(de)結合；3.標(biao)本(ben)的(de)(de)(de)(de)保存時間可(ke)以(yi)(yi)增長，組織(zhi)切片固(gu)定(ding)后，在(zai)－20℃，可(ke)以(yi)(yi)存放一年以(yi)(yi)上而不改變(bian)免(mian)(mian)疫(yi)酶技術的(de)(de)(de)(de)染色；組織(zhi)內有關(guan)抗(kang)(kang)(kang)原不同，則(ze)所用(yong)固(gu)定(ding)劑與(yu)固(gu)定(ding)方(fang)法(fa)也(ye)隨之改變(bian)。

丙(bing)(bing)酮(tong)和乙醇(chun)(chun)是常(chang)用的(de)(de)兩種固(gu)(gu)定劑(ji)。但(dan)對于(yu)(yu)許多病(bing)毒與細菌的(de)(de)定位研(yan)究，選擇丙(bing)(bing)酮(tong)和四氯(lv)化(hua)化(hua)碳作(zuo)為(wei)固(gu)(gu)定劑(ji)是zui合適的(de)(de)；對于(yu)(yu)可(ke)溶(rong)性蛋白(bai)抗原的(de)(de)定位，常(chang)用乙醇(chun)(chun)；對于(yu)(yu)多糖，則用8%－10%福爾馬林，而不用乙醇(chun)(chun)與丙(bing)(bing)酮(tong)等有機(ji)溶(rong)劑(ji)。

對于那些(xie)在表面覆蓋蛋(dan)(dan)白(bai)衣膜的抗原，還(huan)常(chang)用(yong)(yong)胰(yi)蛋(dan)(dan)白(bai)酶、黏蛋(dan)(dan)白(bai)酶、透(tou)明質酸(suan)酶以及受體破壞酶進行(xing)處理。有人報道(dao)，ku味酸(suan)－甲(jia)醛固定液應用(yong)(yong)于肝組織內甲(jia)種胎兒蛋(dan)(dan)白(bai)酶標定位能獲得(de)滿意(yi)結果。

對于植物(wu)病(bing)毒(du)材料的(de)固定(ding)，丙酮用得zui多，乙醇次之。因為(wei)丙酮對病(bing)毒(du)的(de)抗原性損害為(wei)zui小，但對于那些(xie)不穩定(ding)的(de)病(bing)毒(du)，則應避免固定(ding)。

在應用(yong)免疫酶技術時(shi)，固(gu)定處(chu)理對(dui)酶的活(huo)性(xing)的影響也得(de)心(xin)中有數(shu)。許多固(gu)定劑對(dui)抗(kang)(kang)原(yuan)的活(huo)性(xing)都(dou) 會(hui)有所(suo)損害，例如(ru)，福(fu)爾(er)馬(ma)林對(dui)蛋白抗(kang)(kang)原(yuan)的固(gu)定造成抗(kang)(kang)原(yuan)性(xing)的破壞非(fei)常明顯。因此，對(dui)福(fu)爾(er)馬(ma)林的使用(yong)必(bi)須嚴格控制濃度(du)，一般使用(yong)的福(fu)爾(er)馬(ma)林濃度(du)為10%，盡管如(ru)此，對(dui)抗(kang)(kang)原(yuan)的抗(kang)(kang)原(yuan)性(xing)還是(shi)有損害，所(suo)以(yi)必(bi)須進(jin)行(xing)抗(kang)(kang)原(yuan)修復。

另外(wai)，對于堿性磷酸酶，在4℃下，丙酮固(gu)定(ding)(ding)一晝夜，能喪(sang)(sang)(sang)失(shi)(shi)30%的活(huo)性，如用丙酮固(gu)定(ding)(ding)后包埋，則(ze)喪(sang)(sang)(sang)失(shi)(shi)70%的活(huo)性；在4℃下，福爾馬(ma)林固(gu)定(ding)(ding)2－4h，則(ze)喪(sang)(sang)(sang)失(shi)(shi)25%的活(huo)性。

固(gu)定條(tiao)件(jian)對標本(ben)的固(gu)定效果作(zuo)用較大(da)。

固定劑(ji)濃度：丙酮(tong)zui常用(yong)的是100%；乙(yi)醇(chun)zui常用(yong)95%，但(dan)是70%乙(yi)醇(chun)的固定力為zui強；福爾馬林(lin)常用(yong)10%。

固(gu)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)溫(wen)(wen)度：一般而言，固(gu)定(ding)(ding)作(zuo)用(yong)(yong)隨溫(wen)(wen)度升高(gao)而加強，室溫(wen)(wen)是zui常用(yong)(yong)的(de)(de)(de)。固(gu)定(ding)(ding)溫(wen)(wen)度可以－70－30℃。應(ying)根(gen)據(ju)不(bu)同的(de)(de)(de)抗原使用(yong)(yong)不(bu)同的(de)(de)(de)溫(wen)(wen)度，麻疹病(bing)毒應(ying)在－20－40℃用(yong)(yong)丙酮固(gu)定(ding)(ding)30min，而酶可以37℃用(yong)(yong)乙醇固(gu)定(ding)(ding)15min.

固(gu)定液的(de)pH：一(yi)般以(yi)所用固(gu)定劑的(de)pH為準，但若以(yi)酶去除某些抗原(yuan)表面的(de)蛋白衣膜時，應根據(ju)所用酶的(de)性質調節pH。

固(gu)(gu)(gu)定時(shi)的(de)(de)(de)(de)干(gan)濕度：干(gan)濕度一(yi)般情況(kuang)下不需考慮，但(dan)某些(xie)材料在固(gu)(gu)(gu)定時(shi)受(shou)干(gan)濕度影響很大(da)。丙酮對Hela 細胞中的(de)(de)(de)(de)灰質炎病毒固(gu)(gu)(gu)定，在室(shi)溫干(gan)燥(zao)的(de)(de)(de)(de)情況(kuang)下，N抗原就轉變為H抗原；而在－20℃不干(gan)燥(zao)的(de)(de)(de)(de)情況(kuang)下，N抗原保持不變。

固(gu)定的(de)時間(jian)：有長有短(duan)，一般在室溫下，固(gu)定15min左(zuo)右，低溫下固(gu)定30min.如僅為(wei)了使材料不脫落為(wei)了減輕未處理的(de)新(xin)鮮(xian)冰凍切片出(chu)現的(de)空泡，則可用丙酮、乙醇(chun)和甲(jia)醛作(zuo)短(duan)時間(jian)處理。

固定后(hou)的沖(chong)(chong)洗：固定后(hou)的材料常用中性磷(lin)酸緩沖(chong)(chong)液(ye)反復沖(chong)(chong)洗，以(yi)免在(zai)固定過程中可能(neng)彌散出來的物質覆(fu)蓋表面。

固定(ding)標(biao)本(ben)(ben)的保(bao)(bao)存(cun)：標(biao)本(ben)(ben)材料經固定(ding)后，要(yao)(yao)立即使用(yong)于(yu)(yu)免疫(yi)酶(mei)技(ji)術中(zhong)，不(bu)要(yao)(yao)久貯(zhu)。如(ru)實在(zai)(zai)要(yao)(yao)保(bao)(bao)存(cun)，應置于(yu)(yu)冰(bing)箱（4℃）中(zhong)，在(zai)(zai)干(gan)燥的情況下(xia)24h內(nei)(nei)抗(kang)原(yuan)性損失(shi)不(bu)大。在(zai)(zai)－20℃下(xia)，冰(bing)凍切(qie)片或(huo)涂片可(ke)保(bao)(bao)存(cun)1周到(dao)1個月(yue)(yue)，石(shi)蠟切(qie)片可(ke)保(bao)(bao)存(cun)數月(yue)(yue)以上。在(zai)(zai)－20℃下(xia)保(bao)(bao)存(cun)時(shi)，為了(le)防止形(xing)成(cheng)過多的冰(bing)結晶并(bing)發生(sheng)組(zu)(zu)織細胞的變化，應將切(qie)片浸入聚乙烯醇甘油(you)溶液中(zhong)，讓(rang)其在(zai)(zai)－20℃下(xia)形(xing)成(cheng)固態保(bao)(bao)護膜，然后在(zai)(zai)免疫(yi)酶(mei)染色前用(yong)手指加(jia)溫，用(yong)生(sheng)理鹽水輕輕洗(xi)去，每次5min,共洗(xi)3次。這樣保(bao)(bao)存(cun)的標(biao)本(ben)(ben)，污(wu)染增多。某些干(gan)燥標(biao)本(ben)(ben)（例如(ru)組(zu)(zu)織內(nei)(nei)阿米巴抗(kang)原(yuan)、組(zu)(zu)織自身(shen)抗(kang)原(yuan)）貯(zhu)于(yu)(yu)辛烷(wan)中(zhong)可(ke)長期保(bao)(bao)存(cun)（－30℃），并(bing)且幾(ji)乎無污(wu)染。

固定(ding)(ding)(ding)的程序(xu)很簡單，將固定(ding)(ding)(ding)劑(ji)用吸管加到標本上(shang)去，或將標本置于玻片(pian)架上(shang)浸(jin)入固定(ding)(ding)(ding)劑(ji)溶液(ye)中(zhong)，固定(ding)(ding)(ding)后立(li)即用磷酸(suan)緩沖液(ye)沖洗(xi)，然后在空氣中(zhong)晾干(gan)或風扇吹干(gan)。