犬黑熱病(L.donovani)ELISA試(shi)劑盒使(shi)用(yong)說(shuo)明書

本試劑盒僅供研究使(shi)用。

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使(shi)用目的：

本試(shi)劑盒用于測定犬(quan)血清，血漿及相關液體樣本中黑(hei)熱(re)病(L.donovani)表達。

實驗原(yuan)理

本(ben)試劑(ji)盒應用(yong)雙抗體(ti)夾心法測定標本(ben)中犬黑熱病(L.donovani)表(biao)達。用純化(hua)的(de)犬(quan)黑(hei)熱(re)病(L.donovani)抗體(ti)包被微孔板，制成固相抗(kang)體，可與樣品中黑熱病(L.donovani)相結合，經(jing)洗滌除去未結合的抗原和其他成分后再與(yu)HRP標記的黑熱病(bing)(L.donovani)抗體(ti)結合，形成抗體(ti)-抗原-酶標抗(kang)體(ti)復合物，經過che底洗滌后加(jia)底(di)物(wu)TMB顯色。TMB在(zai)HRP酶的(de)催(cui)化(hua)(hua)下轉化(hua)(hua)成(cheng)藍色，并在(zai)酸(suan)的(de)作用(yong)下轉化(hua)(hua)成(cheng)最(zui)終的(de)黃(huang)色。用(yong)酶標儀在(zai)450nm波長(chang)下測定吸光(guang)度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biao)本中犬黑熱病(bing)(L.donovani)的存在與否。

試(shi)劑盒組成

標本要求 

1．標本(ben)采集后盡(jin)早(zao)進(jin)行(xing)提取(qu)(qu)，提取(qu)(qu)按(an)相關(guan)文獻進(jin)行(xing)，提取(qu)(qu)后應盡(jin)快進(jin)行(xing)實(shi)驗。若不能馬上進(jin)行(xing)試驗，可將標本(ben)放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣(yang)品，因NaN3抑制辣根過氧(yang)化物酶的（HRP）活性。

操(cao)作步驟

1. 編(bian)號：將樣品對應(ying)微孔按(an)序編(bian)號，每板應(ying)設陰性對照2孔、陽性對(dui)照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣(yang)品及(ji)酶(mei)標試劑，其余各步操作相同）

2. 加(jia)樣：分別(bie)在陰、陽(yang)性對照(zhao)孔中加(jia)入陰性對照(zhao)、陽(yang)性對照(zhao)50μl。然后(hou)在待測(ce)樣品孔(kong)先加樣品(pin)稀釋液40μl，然后再加待測樣(yang)品10μl。加(jia)樣將樣品(pin)加(jia)于酶(mei)標板孔底(di)部，盡量不(bu)觸及孔壁，輕輕晃(huang)動混勻，

3. 溫育(yu)：用封板膜封板后置37℃溫育(yu)30分鐘。   

4. 配液：將30倍濃縮洗滌(di)液用蒸餾(liu)水30倍稀(xi)釋后備用

5. 洗滌：小(xiao)心揭(jie)掉封板膜(mo)，棄去液體，甩(shuai)干，每孔加(jia)滿洗(xi)滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加(jia)酶：每孔加(jia)入(ru)酶標試劑50μl，空(kong)白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作(zuo)同5。

9. 顯色(se)：每孔先加入顯色(se)劑A50μl，再加(jia)入顯(xian)色劑B50μl，輕(qing)輕(qing)震蕩混勻(yun)，37℃避光顯色10分(fen)鐘.

10. 終(zhong)止(zhi)：每孔加終(zhong)止(zhi)液50μl，終止反應（此時藍(lan)色(se)立轉黃色(se)）。

11. 測(ce)定：以空白孔調(diao)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終(zhong)止液后15分鐘(zhong)以內進行。

計算和(he)結果判定：

  試驗有效性(xing)(xing)：陽性(xing)(xing)對照(zhao)孔(kong)平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.20

  臨界值（CUT OFF）計算：臨界值(zhi)=陰性對照孔平均值+0.15

  陰性判定：樣品OD值< 臨界(jie)值(zhi)（CUT OFF）者為黑熱病(bing)(L.donovani)陰性

  陽性(xing)判定(ding)：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為黑熱病(L.donovani)陽性。

注意事項

1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。

2．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

3．濃洗(xi)滌(di)液可能(neng)會有(you)結晶析(xi)出，稀釋時可在水浴(yu)中加溫助(zhu)溶，洗滌時(shi)不(bu)影響結果。

4． 封板膜只限一次性使(shi)用(yong)，以(yi)避免交叉污染。

5．底物請避光保存。

6．試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。

保(bao)存條件及有效(xiao)期

1．試劑(ji)盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月