1.樣本類型和采集：

血清(qing)：將收(shou)集(ji)于血(xue)(xue)清(qing)分離管的全血(xue)(xue)標(biao)本在(zai)室(shi)溫放置0.5-2小時或4℃過夜，然(ran)后1000×g離心20 分(fen)鐘，取上清即(ji)可，或將上清置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免(mian)反復凍融。
 血漿：用(yong)EDTA或肝素(su)作為抗凝劑采集(ji)標(biao)本，并(bing)將標(biao)本在采集(ji)后的(de)30分(fen)鐘內(nei)于2-8℃ 1000×g離(li)心(xin)15分鐘(zhong)，取上清(qing)即可檢測，或將上清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但(dan)應(ying)避免反復凍融。

組織勻漿：用預(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組(zu)織(zhi)，去除殘留(liu)血液（勻漿中裂解的(de)紅細胞會影響測量(liang)結果(guo)），稱(cheng)重后將剪碎(sui)的(de)組(zu)織(zhi)與對應體(ti)積的(de)PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品(pin)對應(ying)9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調(diao)整(zheng)，并做好記錄(lu)。推薦在(zai)PBS中加入(ru)蛋白酶抑(yi)制劑）加入(ru)玻璃(li)勻(yun)漿(jiang)器中，于冰上充分研磨。為了進(jin)(jin)一步裂解組織(zhi)細胞，可以對勻(yun)漿(jiang)液進(jin)(jin)行超聲破碎，或(huo)反復凍融。最后將勻(yun)漿(jiang)液于5000×g離心5~10分(fen)鐘，取上清即(ji)可檢(jian)測，或將上清置于(yu)-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反(fan)復凍融。

細胞裂解(jie)液: 吸棄培養(yang)液，用PBS（0.01 M，pH 7.4）將(jiang)(jiang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)洗(xi)一遍。用(yong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)刮(gua)刮(gua)下細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，加入2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。懸(xuan)浮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)可省略。收集細(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸(xuan)液，4℃ 1000×g離心(xin)10min，棄(qi)去培養基，用(yong)預冷的(de)(de)(de)PBS潤洗(xi)3次。加入適量的(de)(de)(de)預冷PBS或非變性細(xi)(xi)胞(bao)(bao)裂解液（臨(lin)用(yong)前加入蛋白酶抑制劑）重(zhong)(zhong)懸(xuan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao),通常(chang)6孔(kong)板一個孔(kong)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)量需要150-250μL PBS重(zhong)(zhong)懸(xuan)。 將(jiang)(jiang)樣(yang)品放入-20℃或-80℃，使樣(yang)品冷凍(dong)(dong)，再放室(shi)溫解凍(dong)(dong)樣(yang)品，反復凍(dong)(dong)融(rong)3次，使細(xi)(xi)胞(bao)(bao)充分裂解,也可將(jiang)(jiang)樣(yang)品進行超聲破碎，以(yi)達到裂解的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)。4℃ 10000×g 離心(xin)10min，除去細(xi)(xi)胞(bao)(bao)碎片，取上清即可檢(jian)測，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應(ying)避免反復凍融。

細胞培(pei)養物上清(qing)或其(qi)它生物標本：請1000×g離(li)心20分鐘(zhong)，取上清(qing)即可檢測，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復(fu)凍融(rong)。

2.樣本保(bao)存和穩定(ding)性

樣(yang)本(ben)在2-8℃條件下(xia)，可(ke)以儲存72h，在- 20℃或-80℃可以儲存6個月及以(yi)上。樣(yang)本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量(liang)分裝凍(dong)存，避免反復凍(dong)融。

步驟：

1. 編(bian)號(hao)(hao)：將樣品對應(ying)微孔按序編(bian)號(hao)(hao)，每板應(ying)設陰性對照(zhao)2孔(kong)(kong)、陽性對(dui)照(zhao)2孔(kong)(kong)、空白對(dui)照(zhao)1孔(kong)(kong)（空白對(dui)照(zhao)孔(kong)(kong)不加(jia)樣品及(ji)酶標試劑，其余各步操作相同）。

2. 加(jia)樣：分別在陰(yin)、陽性對照(zhao)孔中加(jia)入陰(yin)性對照(zhao)、陽性對照(zhao)50μl。然后在(zai)待(dai)測樣(yang)品孔先加樣(yang)品稀(xi)釋液40μl，然后再(zai)加待(dai)測樣(yang)品10μl。加樣(yang)將樣(yang)品加于(yu)酶(mei)標板孔底部，盡(jin)量(liang)不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育(yu)：用(yong)封板膜封板后(hou)置37℃溫育30分鐘。  

4. 配液：將30倍(bei)濃縮洗滌液用蒸餾水30倍(bei)稀釋后備用。

5. 洗滌：小心(xin)揭掉封板膜，棄(qi)去液(ye)體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置(zhi)30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白(bai)孔除外。

7. 溫育(yu)：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘(zhong)。

8. 洗滌(di)：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗(xi)滌液，靜(jing)置(zhi)30秒后(hou)棄去，如此重(zhong)復5次，拍干。

9. 顯色(se)：每(mei)孔先(xian)加入顯色(se)劑A50μl，再加入顯(xian)色(se)劑(ji)B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘。

10.終(zhong)止：每孔(kong)加終(zhong)止液(ye)50μl，終止反應（此時藍色(se)(se)立轉黃(huang)色(se)(se)）。

11.測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各(ge)孔的吸光度（OD值）。測定應在加(jia)終止液后15分鐘以內進(jin)行。

注意：

1. 試劑(ji)準備：試劑(ji)盒從冷藏環境中(zhong)取出(chu)應在(zai)室溫平衡15-30分鐘后方可使用(yong)(yong)。準備(bei)一次實驗(yan)所需要的酶標(biao)條，其它(ta)的可從微孔板上拆下，密(mi)封(feng)，按照說明書要求保存，以(yi)備(bei)下次使用(yong)(yong)。

2. 加(jia)(jia)樣(yang)：實驗操作中請使(shi)用一(yi)次性的(de)滅菌吸頭(tou)，避免(mian)污(wu)染。加(jia)(jia)樣(yang)時(shi)注意(yi)不(bu)要有氣泡產生，將樣(yang)品加(jia)(jia)于酶(mei)標板底部，盡量不(bu)觸及孔(kong)壁，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)晃動(dong)混勻。與反應試(shi)劑加(jia)(jia)入(ru)一(yi)樣(yang)，加(jia)(jia)樣(yang)過程(cheng)中第(di)一(yi)個孔(kong)與最(zui)后一(yi)個孔(kong)加(jia)(jia)樣(yang)時(shi)間(jian)間(jian)隔(ge)盡量小（一(yi)般控(kong)制在(zai)10 分鐘以內），如果(guo)太大，將會導(dao)致不同的“預溫育"時間，從而明(ming)顯地影響到(dao)測(ce)量值的準(zhun)確性(xing)(xing)及重(zhong)復性(xing)(xing)。為了測(ce)值的準(zhun)確性(xing)(xing)，推薦設置復孔進行實驗。

3. 溫育(yu)(yu)：為(wei)防止(zhi)樣(yang)品蒸(zheng)發(fa)，實驗時(shi)請將(jiang)加(jia)上蓋或(huo)覆膜(mo)的(de)酶標板置于(yu)(yu)濕(shi)盒內，以避免液體(ti)蒸(zheng)發(fa)，洗板后(hou)應盡快(kuai)進行下(xia)步(bu)操作，任(ren)何時(shi)侯(hou)都應避免酶標板處(chu)于(yu)(yu)干燥狀態，同時(shi)應嚴(yan)格遵守給定的(de)溫育(yu)(yu)時(shi)間和溫度。

4. 洗滌：濃洗滌(di)液可能(neng)會有結晶析(xi)出(chu)，稀釋時可在(zai)水浴中加溫助溶，洗(xi)滌時不(bu)影(ying)響結果。充分洗(xi)滌非常重要(yao)，在每次洗(xi)滌過(guo)(guo)程中，都要(yao)將(jiang)洗(xi)滌液*甩(shuai)干(gan)。洗(xi)滌過(guo)(guo)程中反(fan)應(ying)孔內(nei)殘留(liu)的洗(xi)滌液應(ying)在吸水(shui)紙上拍干(gan)，勿將(jiang)吸水(shui)紙直接放(fang)入反(fan)應(ying)孔中吸水(shui)，同時要(yao)輕輕擦除板底殘留(liu)的液體和手指印，避免影(ying)響最(zui)后(hou)的酶標儀讀數。如(ru)果使用自動洗(xi)板機，請在熟練使用后(hou)再用于正式實驗過(guo)(guo)程中。

5. 反(fan)應(ying)(ying)時(shi)間的(de)(de)控(kong)制：加入(ru)底(di)物后(hou)請(qing)定時(shi)觀察反(fan)應(ying)(ying)孔的(de)(de)顏(yan)色變化，如(ru)觀察到顏(yan)色較(jiao)深，請(qing)提前加入(ru)終止液終止反(fan)應(ying)(ying)，避免反(fan)應(ying)(ying)過(guo)強(qiang)而(er)影響酶(mei)標儀光(guang)密度讀(du)數。

6. 底物：底物請(qing)避(bi)光保存(cun)，在(zai)儲(chu)存(cun)和(he)溫(wen)育時避(bi)免強光直接(jie)照射(she)。