1.樣本類型和采集：

血清：將收集于(yu)血清(qing)分離管的全血標(biao)本在室溫放置(zhi)0.5-2小時或4℃過夜(ye)，然(ran)后1000×g離心20 分鐘，取上清(qing)即可，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復(fu)凍(dong)融。
 血漿：用(yong)EDTA或肝素作為(wei)抗凝劑(ji)采集標本(ben)，并將標本(ben)在采集后(hou)的30分(fen)鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取(qu)上清(qing)即可(ke)檢測，或將(jiang)上清(qing)置于-20℃或-80℃保存(cun)，但應避免反復凍融(rong)。

組織(zhi)勻漿：用預(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解(jie)的紅細胞(bao)會影響(xiang)測(ce)量結(jie)果），稱重后將剪碎的組織與對應體積(ji)的PBS（一般按1:9的重量(liang)體(ti)積比，比如1g的組(zu)織樣品對應9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可根據實驗需(xu)要適(shi)當調(diao)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑）加入玻璃勻(yun)(yun)漿器中，于(yu)冰上充分研磨。為了進(jin)一步裂解(jie)組織細胞，可以對勻(yun)(yun)漿液進(jin)行超聲(sheng)破碎，或反(fan)復凍融。最后將(jiang)勻(yun)(yun)漿液于(yu)5000×g離心5~10分鐘，取上(shang)清即(ji)可(ke)檢(jian)測(ce)，或將上清置(zhi)于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反(fan)復(fu)凍融(rong)。

細胞裂解液: 吸(xi)棄培(pei)養液，用(yong)PBS（0.01 M，pH 7.4）將(jiang)細(xi)胞(bao)(bao)洗一遍。用(yong)細(xi)胞(bao)(bao)刮刮下細(xi)胞(bao)(bao)，加入(ru)2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)(bao)可(ke)(ke)省略。收集(ji)細(xi)胞(bao)(bao)懸(xuan)液(ye)，4℃ 1000×g離心10min，棄去培養基，用(yong)預(yu)冷的PBS潤洗3次。加入(ru)適量的預(yu)冷PBS或非(fei)變性細(xi)胞(bao)(bao)裂(lie)(lie)解(jie)液(ye)（臨用(yong)前(qian)加入(ru)蛋白酶抑制劑(ji)）重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞(bao)(bao),通(tong)常6孔板一個(ge)孔的細(xi)胞(bao)(bao)量需要150-250μL PBS重(zhong)懸(xuan)。 將(jiang)樣(yang)品(pin)放入(ru)-20℃或-80℃，使(shi)樣(yang)品(pin)冷凍，再(zai)放室溫解(jie)凍樣(yang)品(pin)，反復(fu)凍融3次，使(shi)細(xi)胞(bao)(bao)充(chong)分(fen)裂(lie)(lie)解(jie),也可(ke)(ke)將(jiang)樣(yang)品(pin)進行超聲破碎(sui)，以達(da)到裂(lie)(lie)解(jie)的目的。4℃ 10000×g 離心10min，除去細(xi)胞(bao)(bao)碎(sui)片，取上(shang)清即(ji)可(ke)(ke)檢(jian)測，或將(jiang)上清置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反(fan)復凍融(rong)。

細胞培養(yang)物上清或(huo)其它生物標本：請(qing)1000×g離(li)心20分鐘，取上清即(ji)可(ke)檢測，或將(jiang)上清置于-20℃或-80℃保存(cun)，但應避免反復凍融。

2.樣本保(bao)存和穩定性

樣(yang)本(ben)在(zai)2-8℃條件下(xia)，可以儲存(cun)72h，在- 20℃或-80℃可以儲存6個月(yue)及(ji)以上。樣本收集后，不(bu)是一次(ci)檢測完(wan)，請按一次(ci)用量分(fen)裝凍(dong)存，避免反復凍(dong)融。

步驟：

1. 編號：將樣(yang)品對(dui)應(ying)微孔(kong)按(an)序(xu)編號，每板(ban)應(ying)設陰性(xing)對(dui)照2孔、陽性對(dui)(dui)照2孔、空白(bai)對(dui)(dui)照1孔（空白(bai)對(dui)(dui)照孔不加樣品及酶標試劑，其余各(ge)步(bu)操作相同）。

2. 加樣(yang)：分別在陰、陽(yang)性對照(zhao)孔中(zhong)加入陰性對照(zhao)、陽(yang)性對照(zhao)50μl。然后在待測樣品孔先加(jia)樣品稀(xi)釋液(ye)40μl，然后再加(jia)待測樣品10μl。加(jia)樣將樣品加(jia)于(yu)酶標板孔底(di)部(bu)，盡(jin)量不觸(chu)及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4. 配(pei)液：將30倍濃縮(suo)洗滌液用(yong)(yong)蒸(zheng)餾水30倍稀釋后備用(yong)(yong)。

5. 洗(xi)滌(di)：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(man)洗滌液，靜置30秒后棄(qi)去(qu)，如此重(zhong)復5次，拍干。

6. 加酶(mei)：每孔加入(ru)酶(mei)標(biao)試劑50μl，空白孔除外(wai)。

7. 溫育：用封板膜封板后(hou)置37℃溫育30分鐘。

8. 洗(xi)滌(di)：小心揭(jie)掉封板膜，棄去液體(ti)，甩干(gan)，每孔加滿洗滌液(ye)，靜置30秒后棄去(qu)，如(ru)此重復5次，拍(pai)干。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再(zai)加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避(bi)光顯色10-20分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止(zhi)反(fan)應（此時藍色立轉(zhuan)黃色）。

11.測(ce)定：以空白孔調零，450nm波長(chang)依(yi)序測量各(ge)孔的吸(xi)光(guang)度（OD值）。測(ce)定應(ying)在加終止液后15分(fen)鐘以內(nei)進行。

注意：

1. 試(shi)劑(ji)準備：試(shi)劑(ji)盒從冷藏環境(jing)中(zhong)取出應在室溫平(ping)衡15-30分鐘(zhong)后方可使用。準備一次實驗所(suo)需要的(de)酶標(biao)條，其它的(de)可從微孔板上拆下，密(mi)封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2. 加(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)：實驗操作中(zhong)請使用(yong)一(yi)(yi)次性(xing)的滅菌(jun)吸頭，避免污染。加(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)時(shi)注意不(bu)要有(you)氣泡產生，將樣(yang)(yang)(yang)品加(jia)(jia)于(yu)酶標板底(di)部，盡(jin)量不(bu)觸及孔(kong)壁，輕輕晃動混(hun)勻。與反應試劑加(jia)(jia)入一(yi)(yi)樣(yang)(yang)(yang)，加(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)過(guo)程中(zhong)第一(yi)(yi)個(ge)孔(kong)與最后一(yi)(yi)個(ge)孔(kong)加(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)時(shi)間間隔盡(jin)量小（一(yi)(yi)般控制(zhi)在10 分鐘以內(nei)），如果太(tai)大，將會導致不同的“預溫育"時間，從而明顯地影(ying)響(xiang)到測量值的準確(que)性及重復(fu)性。為了測值的準確(que)性，推(tui)薦設置復(fu)孔進行實驗。

3. 溫育：為防(fang)止樣品蒸(zheng)發，實驗時請(qing)將加上蓋或覆膜的(de)酶(mei)標板(ban)置于(yu)濕盒內，以避(bi)免(mian)液體蒸(zheng)發，洗板(ban)后應盡快進(jin)行下步(bu)操作，任何(he)時侯都(dou)應避(bi)免(mian)酶(mei)標板(ban)處于(yu)干燥狀(zhuang)態，同(tong)時應嚴格(ge)遵守給定的(de)溫育時間和溫度。

4. 洗(xi)滌(di)：濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水(shui)浴中加溫(wen)助溶(rong)，洗滌(di)(di)時不影(ying)響結果。充分洗滌(di)(di)非常重要，在每次洗滌(di)(di)過程(cheng)(cheng)中(zhong)，都要將洗滌(di)(di)液(ye)*甩干。洗滌(di)(di)過程(cheng)(cheng)中(zhong)反(fan)應(ying)孔(kong)內殘留的(de)洗滌(di)(di)液(ye)應(ying)在吸水(shui)紙上拍干，勿將吸水(shui)紙直(zhi)接(jie)放(fang)入反(fan)應(ying)孔(kong)中(zhong)吸水(shui)，同時要輕輕擦(ca)除(chu)板底殘留的(de)液(ye)體和手指印，避免影(ying)響最后(hou)的(de)酶標儀讀(du)數。如果使用(yong)自動(dong)洗板機，請在熟(shu)練使用(yong)后(hou)再用(yong)于正式實驗過程(cheng)(cheng)中(zhong)。

5. 反應(ying)時間的控(kong)制(zhi)：加(jia)入底物后請定時觀察反應(ying)孔(kong)的顏色變化，如(ru)觀察到顏色較深，請提前(qian)加(jia)入終(zhong)止液終(zhong)止反應(ying)，避免(mian)反應(ying)過強而影響酶(mei)標儀(yi)光密度讀數。

6. 底物：底物請(qing)避(bi)光保存，在儲(chu)存和溫(wen)育時避(bi)免(mian)強光直(zhi)接(jie)照射。